摘 要

正 文

維生素在人體生長代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是人體必須的微量營養(yǎng)素，缺乏或過量都會對人體健康產(chǎn)生不利影響。維生素A、D、E是脂溶性維生素，研究表明缺乏這些維生素會增加患夜盲癥、骨質(zhì)疏松、心血管疾病及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1],嬰幼兒及未成年人缺乏其對生長發(fā)育的影響則更為明顯[2-4]。目前維生素檢測的方法主要有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-14]等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、重現(xiàn)性好、可同時(shí)快速檢測多種維生素已成為很多臨床實(shí)驗(yàn)室的***選方法。但是目前的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法血液需求量較大[10,13],檢測項(xiàng)目單***[8-9,14]或檢測時(shí)間較長[11],不能滿足臨床同時(shí)快速檢測多個(gè)項(xiàng)目的需求，特別是嬰幼兒采血困難采血量很難滿足需求。雖然已有部分學(xué)者建立微量檢測方法用于維生素檢測，但是這些方法需要衍生化過程，前處理復(fù)雜耗時(shí)較長[8-9,14]。因此，建立能夠用微量血液同時(shí)快速檢測多種維生素的方法滿足臨床不同年齡段的檢測需求顯得尤為必要。

此外，視黃醇，維生素D的代謝產(chǎn)物25-OH-VD2、25-OH-VD3,α-生育酚是脂溶性維生素A、D、E在血液循環(huán)中的主要存在形式，常作為脂溶性維生素檢測的***選指標(biāo)[15-18]。γ-生育酚是維生素E主要的飲食攝入形式，但其與α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(α-TTP)的親和力較低，在體內(nèi)含量較α-生育酚低，但是，近年來文獻(xiàn)報(bào)道其在人體健康活動(dòng)中也扮演著重要角色[19]。本文建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)快速檢測微量血清中視黃醇，維生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)和α-、β-、γ-生育酚的方法，滿足臨床各年齡段尤其是對嬰幼兒同時(shí)快速檢測多種維生素的需求。

１實(shí)驗(yàn)部分

１.１　 儀器與試劑　

１.２　 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制　 

用無水乙醇配制視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100μg/mL；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各1000μg/mL，并用紫外分光光度計(jì)對其濃度進(jìn)行校正[18,20]。用甲醇配制25-OH-VD2標(biāo)準(zhǔn)品儲備液25μg/mL和25-OH-VD3標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100μg/mL，視黃醇-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲備液100μg/mL，25-OH-VD2-d3標(biāo)準(zhǔn)品儲備液50μg/mL，25-OH-VD3-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲備液50μg/mL，α-生育酚-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1000μg/mL。

將各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液用復(fù)溶液(初始流動(dòng)相)稀釋混勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(視黃醇2.50μg/mL、25-OH-VD2 0.20μg/mL、25-OH-VD3 0.40μg/mL、α-生育酚50.00μg/mL、β-生育酚5.00μg/mL、γ-生育酚 5.00μg/mL)；將各同位素標(biāo)品儲備液用甲醇稀釋混勻，配制成混合內(nèi)標(biāo)工作液(視黃醇-d6 2.00μg/mL、25-OH-VD2-d3 0.10μg/mL、25-OH-VD3 0.20μg/mL、α-生育酚-d6 20.0μg/mL)。取4g BSA溶解于100mL水中配成4% BSA溶液。

１.３　 樣本前處理　 

取血清樣品20μL至2mL離心管中，加入10μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，80μL水，2000r/min渦旋振蕩30s后加入200μL甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，2000r/min混勻60s；加入800μL正己烷，2000r/min，混勻5min，然后4℃，12000r/min離心5min；吸取600μL上清液至1.5mL離心管中，室溫下氮?dú)獯蹈桑患?00μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩60s，4℃，12000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待分析。

１.４　 色譜 － 質(zhì)譜條件　 

采用Phenomenex Kinetex F5(100mm × 2.1mm, 2.6μm)色譜柱，柱溫35℃，流動(dòng)相A含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～2.0min，70%B，2.0～2.5min，70%～88% B，2.5～3.5min，88% B，3.5～3.51min，88%～81%B，3.51～11.0min，81% B，11.0～12.0min，81%～70%B，流速0.5mL/min。進(jìn)樣量：20μL。

采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、電噴霧正離子模式(ESI+)，離子源溫度 150℃，脫溶劑溫度500℃，毛細(xì)管電壓3kV，脫溶劑氣流速1000L/h；6種脂溶性維生素的MRM 離子參數(shù)見表1。

２　 結(jié)果與討論

２.１　 前處理?xiàng)l件優(yōu)化　 

２.２ 　 液 相 色 譜 條 件 優(yōu) 化 　 

Kinetex F5色譜柱可以實(shí)現(xiàn)所有組分包括β、γ-生育酚的分離。此外，25-OH-VD3同分異構(gòu)體3-epi-25-OH-VD3在嬰幼兒體內(nèi)含量較高，對維生素D含量測定影響較大[21]，該色譜柱可以實(shí)現(xiàn)25-OH-VD3和3-epi-25-OH-VD3的分離，減少3-epi-25-OH-VD3對檢測結(jié)果的影響。故采用Kinetex F5色譜柱進(jìn)行所有組分的分離(見圖2)。研究發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入甲酸銨后其促進(jìn)目標(biāo)化合物離子化的效果較加入乙酸銨好，響應(yīng)值增加明顯，故在水相和有機(jī)相中均加入2.5mmol/L甲酸銨。

２.３　 線性范圍、檢出限和定量限　 

２.４　 方法精密度　

將低、中、高三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入4% BSA混合血清樣本經(jīng)本法處理后進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)6次，連續(xù)檢測三天，計(jì)算日內(nèi)精密度為0.9%～9.6%，日間精密度為3.0%～9.3%(見表3)。該方法同時(shí)測定6種脂溶性維生素的日內(nèi)精密度和日間精密度均在15%以內(nèi)，方法精密度滿足檢測需求。

２.５　 方法準(zhǔn)確度　 

將低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入混合血清樣本中按本法進(jìn)行前處理后進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)6次，計(jì)算加標(biāo)回收率，3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為86.6%～107.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.46%～9.39%(見表4)。該方法加標(biāo)回收率均在80%～120%以內(nèi)，方法準(zhǔn)確度高滿足檢測需求。

采用建立的UPLC-MS/MS方法對美*********標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)制定的標(biāo)準(zhǔn)參照品SRM 968f進(jìn)行檢測，每個(gè)水平重復(fù)2次取平均值，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，除25-OH-VD2含量較低未能檢出外，其它檢測結(jié)果與靶值偏差均在5%以內(nèi)，該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠(表5)。

２.７　 實(shí)際樣品測定　 

使用本方法對17份健康兒童血液樣本進(jìn)行檢測，其中視黃醇含量為0.22～0.43μg/mL，25-OH-VD2含量為未檢出～5.19ng/mL，25-OH-VD3含量為6.83～49.21ng/mL，α-生育酚含量為5.63～12.73μg/mL，β-生育酚含量為0.03～1.37μg/mL，γ-生育酚含量為0.11～1.68μg/mL。本法適用于微量臨床血液樣本6種脂溶性維生素的同時(shí)快速檢測。

３結(jié)　 論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定微量血清樣本中多種脂溶性維生素的方法，并對前處理過程中的蛋白沉淀試劑、萃取液用量，復(fù)溶液等進(jìn)行了優(yōu)化，以減少色譜圖中噪音干擾，改善色譜峰形，提高檢測靈敏度。并比較了不同色譜柱對多種脂溶性維生素尤其是不同類型維生素E的分離效果，***終選擇Phenomenex Kinetex F5色譜柱，該色譜柱可以實(shí)現(xiàn)β-生育酚和γ-生育酚的有效分離。本研究中只需20μL血清就能夠快速完成6種脂溶性維生素的測定。該方法測定樣本需求量少、操作簡單、檢測結(jié)果準(zhǔn)確快速可實(shí)現(xiàn)大量臨床樣本的同時(shí)檢測，尤其對采血較為困難的嬰幼兒可以實(shí)現(xiàn)少量血液樣本檢測多數(shù)項(xiàng)目的需求。

(文章來源于互聯(lián)網(wǎng))