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還在用紫外吸收法定量蛋白質?更高靈敏度的蛋白質定量神器來襲 | 技術頭條

2024-11-11 09:24:00

還在使用紫外吸收法進行蛋白質定量分析?告別低靈敏度、對樣品純度要求高(如體系中殘留的核酸干擾吸光度)的蛋白質定量!


現在,僅需***臺 Duetta? 熒光及吸收光譜儀,操作簡單、超低檢測限、杜絕殘留核酸的干擾,快速實現蛋白質/抗體的定量分析。




摘 要

本文介紹了 Duetta? 在檢測極低濃度轉鐵蛋白時所展現出的高靈敏度特性。Duetta? 熒光及吸收光譜儀能夠同步進行熒光光譜和吸收光譜的測量,靈敏度較紫外吸收法提高33倍。

*轉鐵蛋白是***種在肝臟中合成的糖蛋白,分子量為80 kDa。測量血清中的轉鐵蛋白鐵水平是鐵代謝研究的重要組成部分。

圖 1 轉鐵蛋白三維結構



實驗方法


使用10 mM PBS,配制濃度范圍為0.75 μg/mL 至 50 μg/mL 的轉鐵蛋白溶液,用于熒光和吸收光譜測量。使用相同的緩沖液(不含蛋白)作為空白對照。

*實驗使用的激發波長為250 nm,發射波長為265 nm到 550 nm,CCD 積分時間為2秒,狹縫為10 nm。本實驗使用臺式分光光度計作為對比。



結 果



01. 吸收光譜模式

在3種不同濃度下,使用 Duetta? 和臺式分光光度計檢測轉鐵蛋白溶液的吸收光譜,如圖2所示。Duetta? 對轉鐵蛋白的檢測限為12.5 μg/mL,信號強度與濃度呈正相關;而分光光度計的檢測限約為25 μg/mL,曲線噪音非常大。

可見,在相同的紫外吸收模式下,Duetta? 獨特的光路設計使它的靈敏度比臺式分光光度計提高了***倍。


圖 2 兩種儀器的吸收光譜對比


02. 熒光光譜模式

使用 Duetta? 熒光光譜模式檢測轉鐵蛋白溶液的熒光光譜,如圖3所示。對***低濃度的放大結果顯示,檢測限約為0.75 μg/mL。


圖 3 轉鐵蛋白在0.75 μg/mL- 50 μg/mL 的熒光發射光譜


在0.75 μg/mL 至50 μg/mL 的濃度范圍內, Duetta? 在***大發射波長下的熒光強度、分光光度計測得的吸光度、轉鐵蛋白濃度的關系如圖4所示。圖中顯示 Duetta? 對轉鐵蛋白的檢測限約為0.75 μg/mL,熒光強度與濃度呈正相關。對比使用臺式分光光度計檢測到的***低濃度為25 μg/mL,Duetta? 的靈敏度高33倍。


這證實了 Duetta? 在檢測蛋白質時具有遠高于傳統紫外吸收法的靈敏度,因此非常適合用于低濃度蛋白質的定量分析。


圖 4 使用 Duetta? 和分光光度計檢測轉鐵蛋白濃度的比較




結 論


在蛋白質表征中,某些氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的內源熒光使科學***可以在無標記的前提下,實現對蛋白質的表征。

與傳統紫外吸收法相比,Duetta? 具有更高的靈敏度。在檢測轉鐵蛋白時,臺式分光光度計使用吸光法的檢測限約為25 μg/mL,而 Duetta? 熒光法的檢測限能達到0.75 μg/mL,在所使用的參數下,檢測限降低至1/33。通過優化***些參數,如增加積分時間、增加狹縫面積和波長步進等,Duetta? 可以進***步降低檢測限。

Duetta? 熒光及吸收光譜儀可以同步進行熒光光譜和吸收光譜測量,其蛋白濃度檢測的靈敏度高于臺式分光光度計。Duetta? 的雙重用途和絕佳的光路布局是研究蛋白質光譜和低濃度溶液的理想選擇。



儀器推薦

本文使用 HORIBA Duetta? 熒光及吸收光譜儀進行熒光光譜和吸收光譜的測量。Duetta? 可以同步檢測熒光光譜與吸收光譜,是蛋白質定性、定量、聚集分析利器。



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