細(xì)胞阻抗說明
在細(xì)胞生物化學(xué)測定和全身生物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之間定位，基于細(xì)胞的測定是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究不可缺少的工具。然而，許多基于細(xì)胞的測定法的作用通過以下方式被減少：（1）需要使用標(biāo)記；（2）與連續(xù)監(jiān)測不相容（即僅產(chǎn)生終點(diǎn)數(shù)據(jù)）；（3）與正交試驗(yàn)不相容；（ 4）無法提供客觀/定量的讀數(shù)。然而，這些缺點(diǎn)都是通過非侵入性的，無標(biāo)記的和實(shí)時的細(xì)胞阻抗測定來克服的。 細(xì)胞阻抗測定的功能單元是融合到微量滴定板孔的底部表面的一組金微電極（圖1）。當(dāng)浸沒在導(dǎo)電溶液（如緩沖液或標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基）中時，在這些電極上施加電位會使電子離開負(fù)極，通過本體溶液，然后沉積到正極端以完成電路。因?yàn)檫@種現(xiàn)象取決于電極與本體溶液相互作用，所以在電極 - 溶液界面處的粘附細(xì)胞的存在阻礙了電子流動。該阻抗的大小取決于細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞 - 基底附著質(zhì)量。重要的是，金微電極表面和施加的電位（22 mV）都不影響細(xì)胞的健康或行為。
圖1.細(xì)胞阻抗裝置概述在單元格添加之前和之后顯示單個孔的側(cè)視圖。電極和電池都不被拉伸（為了清晰起見，它們被放大）。在不存在電池的情況下，電流自由流動通過培養(yǎng)基，完成電極之間的電路。由于細(xì)胞在電極上粘附并增殖，電流流動受阻，提供了細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量的非常靈敏的讀數(shù)。
阻抗電極
ACEA的實(shí)時微電子檢測板—E-Plate板每孔中的金微電極生物傳感器覆蓋70-80％的表面積（取決于是否存在視野區(qū)域）。而不是圖1所示的簡化的電極對，每個孔中的電極被連接成形成交錯陣列的“線”（圖2）。這種布置可以同時監(jiān)測細(xì)胞群體，從而提供精確的靈敏度：附著于板的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞的大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量。
圖2. ACEA實(shí)時微電子檢測板— E-Plate板上的阻抗電極。 （A）實(shí)時微電子檢測板的每個孔中使用的叉指電極的簡化示意圖。電極沒有按比例繪制（僅顯示一些電極，為了清晰起見，它們已被放大）。雖然細(xì)胞也可以在金電極表面上可視化，但在中間的無電極區(qū)域有助于顯微成像（亮場，熒光等）。（B）16孔E-Plate板中單井的照片。（C）放大陰影電極和未染色人體細(xì)胞的明場圖像。（D）復(fù)合顯微鏡中觀察到的金電極和結(jié)晶紫染色的人細(xì)胞。
實(shí)時阻力跟蹤說明
使用稱為細(xì)胞指數(shù)（CI）的無單位參數(shù)報告了由貼壁細(xì)胞引起的電子流的阻抗，其中CI=(時間點(diǎn)n阻抗-不存在細(xì)胞時阻抗）/標(biāo)稱阻抗值。圖3提供了在建立和運(yùn)行凋亡實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)時阻抗曲線的通用示例。在細(xì)胞添加到孔中的頭幾個小時之后，阻抗快速增加。這是由于懸浮液中的細(xì)胞脫落，沉積在電極上并形成局部粘連。如果添加的細(xì)胞的初始數(shù)量低，并且在井底上存在空的空間，則細(xì)胞將增殖，導(dǎo)致CI逐漸但穩(wěn)定增加。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合CI值時，反映了大容量介質(zhì)可接近的電極表面積不再改變的事實(shí)。此時加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑導(dǎo)致CI降低至零。雖然這個通用實(shí)例涉及細(xì)胞融合時的藥物添加，基于阻抗的測定是非常靈活的，并且還可以評估初始細(xì)胞粘附到電極的速率和程度，或細(xì)胞增殖的速率和程度。
圖3.用于建立和運(yùn)行凋亡測定的通用實(shí)時阻抗曲線。 在文中解釋了阻抗曲線的每個階段及其產(chǎn)生的蜂窩行為。
上述通用示例，圖4顯示了使用ACEA的xCELLigence實(shí)時單元分析（RTCA）儀器中的E-Plate板中采集的實(shí)際實(shí)時阻抗數(shù)據(jù)。 圖4A顯示將A549細(xì)胞添加到E-Plate板后的頭兩個小時的阻抗曲線，其中孔預(yù)先用不同濃度的膠原IV包被。 雖然圖4B顯示了在將HeLa細(xì)胞暴露于GPCR激動劑多巴胺的最初幾分鐘內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞指數(shù)的變化，圖4C評估了在20小時內(nèi)NK細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞的細(xì)胞溶解。 圖4D突出顯示根據(jù)藥物的作用機(jī)制可能在細(xì)胞指數(shù)中發(fā)生的變化。
圖4.使用E-Plate和xCELLigence RTCA儀器獲得的實(shí)時阻抗曲線的示例。 （A）實(shí)時監(jiān)測已經(jīng)預(yù)先涂覆不同濃度膠原IV的E-Plate孔的A549細(xì)胞粘附。請注意阻抗值（細(xì)胞指數(shù)）與顯微鏡中可見的貼壁細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。 （B）暴露于不同濃度GPCR激動劑多巴胺的HeLa細(xì)胞的實(shí)時阻抗曲線。黑色箭頭表示多巴胺加入的時間。 （C）用于NK細(xì)胞介導(dǎo)的MCF7乳腺癌細(xì)胞溶解的實(shí)時阻抗曲線。 （D）暴露于藥物的A549細(xì)胞的實(shí)時阻抗曲線顯示各種作用機(jī)制。
與細(xì)胞相關(guān)的抵抗力
RTCA提供細(xì)胞數(shù)量，增殖率，細(xì)胞大小/形狀和細(xì)胞 - 底物附著質(zhì)量的定量讀數(shù)。由于這些物理性質(zhì)是數(shù)千種不同基因/蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，因此RTCA可以為細(xì)胞健康和行為提供非常廣泛的視野。在xCELLigence儀器上已經(jīng)成功地分析了從內(nèi)皮屏障功能和趨化性到絲狀偽足動力學(xué)和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的一切。盡管它們的廣泛性，xCELLigence測定仍然能夠詢問非常具體的生化和細(xì)胞現(xiàn)象。適當(dāng)使用對照和/或正交技術(shù)使得可以將阻抗跡線的特征與特定的細(xì)胞/分子現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)。要了解如何做到這一點(diǎn)，并且看到xCELLigence RTCA技術(shù)的敏感性和多功能性，請仔細(xì)閱讀這里突出顯示的許多具體應(yīng)用。
軟件
預(yù)定義的協(xié)議指導(dǎo)您在幾秒鐘內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)設(shè)置和分析
圖1.Layout：定義E-Plate板中樣本的排布布局（例如：細(xì)胞類型、細(xì)胞數(shù)目、化合物名稱、化合物濃度）。
對于xCELLigence RTCA DP、DPlus、TP、SP和MP儀器實(shí)驗(yàn)進(jìn)行編程和執(zhí)行，并使用RTCA 2.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。該軟件可實(shí)現(xiàn)輕松的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和執(zhí)行以及強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析，同時仍然保持高效和直觀。軟件如何運(yùn)行和分析實(shí)驗(yàn)的一般概要如下所示。
步驟1：記錄E-Plate板布局
使用直觀的圖形界面，記錄實(shí)時微電子檢測板（E-Plate?板）中每個孔的阻抗值（圖1）。孔的信息領(lǐng)域包括細(xì)胞類型，細(xì)胞數(shù)量，藥物特性，藥物濃度等參數(shù)。表格自動填充功能類似于Excel或其他電子表格程序中可用的功能，可以快速輸入數(shù)據(jù)并自動建立藥物濃度梯度，細(xì)胞數(shù)梯度等。即使正在檢查多種細(xì)胞類型和測定條件，記錄板的所有孔的信息只需幾分鐘。
步驟2：定義數(shù)據(jù)采集參數(shù)
使用第二個表定義數(shù)據(jù)采集的細(xì)節(jié)。這些包括阻抗記錄的頻率和實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間。
步驟3：運(yùn)行實(shí)驗(yàn)
按“Run”并觀察，因?yàn)榘逯械拿總€孔都會實(shí)時獲取阻抗數(shù)據(jù)。即使正在獲取數(shù)據(jù)，也可以查看，圖形化操作，分析和導(dǎo)出。
步驟4：數(shù)據(jù)繪圖和分析
使用直觀的圖形界面，可以繪制來自E-Plate的所有孔或單個孔的實(shí)時阻抗數(shù)據(jù)（圖2A）。可以對來自多個孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，并自動計算和繪制變異系數(shù)。可以容易地調(diào)整x軸和y軸的觀察窗口，并且可以將數(shù)據(jù)軌跡歸一化到特定的時間點(diǎn)（例如在藥物添加之前）。最后，曲線擬合功能可以計算變化率，EC50值等（圖2B）。
圖2.使用RTCA 2.1軟件的數(shù)據(jù)繪圖和分析。 （A）數(shù)據(jù)繪圖/分析窗口的屏幕截圖。這里所有的曲線已經(jīng)被歸一化到藥物治療之前的時間點(diǎn)（用粗體后行垂直線表示）。誤差條表示變異系數(shù)。 （B）劑量反應(yīng)曲線。將細(xì)胞指數(shù)值（在藥物治療后的特定時間）作為藥物濃度的函數(shù)，可以確定EC50值和IC50值。這些類型的計算可以使用內(nèi)置的數(shù)據(jù)分析功能輕松執(zhí)行。
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